For to år siden måtte selskapet Mystery Inc. stenge dørene etter internkrangling. Scooby-Doo, Fred (Freddie Prinze Jr.), Daphne (Sarah Michelle Gellar), Shaggy (Matthew Lillard) og Velma (Linda Cardellini) gikk hver til sitt etter lange og mange kamper mot overnaturlig kriminalitet. Nåblir de bedt om å komme til det skremmende populære feriestedet Spooky Island. Der har flere overnaturlige hendelser satt en støkk i de festglade ungdommene som er kommet for å kople av fra skolen med grønne drinkerog noen gode grøss. Mest bekymret er eieren av Spooky Island, Emile Mondavarious (Rowan Atkinson), som frykter konkurs hvis ungdommene ikke lenger tør å oppsøke det palmesusende paradiset. Scooby-Doo og vennene hansmå legge feidene bak seg for å løse mysteriet som er det største og farligste de har opplevd. Hele verden er i fare, og da trengs en sulten superhelt på fire bein. Kort sagt, Scooby-Doo. Ruh-roh!