Tobey Maguire inntar igjen rollen som den forsiktige Peter Parker som prøver å skape en balanse mellom et liv som student - og et liv som kriminalitetsbekjempende superhelt. Peters liv blir bare mer komplisert når han møter sin nye erkefiende, den briljante Otto Octavius (Alfred Molina), som er reinkarnert som den gale og mangearmede Doc Ock. Når Doc Ock kidnapper MJ (Kirsten Dunst), må Spider-Man på ny komme til unnsetning idet eventyret når nye høyder av makeløs spenning.